page_banner

Uudised

Reaalajas fluorestsentsi kvantitatiivse PCR põhimõttelised tehnikad ja rakendused

Reaalajas fluorestsents-kvantitatiivne PCR on meetod produkti koguhulga mõõtmiseks pärast iga polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) tsüklit DNA amplifikatsioonireaktsioonis, kasutades fluorofoori.Meetodit kasutatakse spetsiifiliste DNA järjestuste kvantifitseerimiseks proovis, mida testitakse sisemiste või väliste võrdlusmeetodite abil.Alates selle loomisest on fluorestsents-kvantitatiivsed PCR-analüüsid muutunud laboriõpetajate seas üha populaarsemaks.

Fluorestsents-PCR põhimõte: Fluorestsents-PCR, algul nimega TaqManPCR ja hiljem ka Real-TimePCR, on uus nukleiinhapete kvantifitseerimise tehnika, mille töötas välja PE (PerkinElmer) USA-s 1995. aastal. Tehnika põhineb fluorestsentsmärgistatud sondi või vastava lisamisel. fluorestseeruv värv tavapärasele PCR-ile, et saavutada selle kvantitatiivne funktsioon.Põhimõte: PCR reaktsiooni edenedes PCR reaktsiooni produktid akumuleeruvad ja fluorestsentssignaali intensiivsus suureneb võrdselt.Iga tsükliga kogutakse fluorestsentsi intensiivsuse signaal, et saaksime jälgida toote koguse muutust fluorestsentsi intensiivsuse muutuse järgi ja seega saada fluorestsentsi võimenduskõvera graafik.

Reaalajas fluorestsents3
Reaalajas fluorestsents2

Üldiselt võib fluorestsentsi võimenduskõvera jagada kolmeks faasiks: fluorestsentsi taustasignaali faas, fluorestsentsi signaali eksponentsiaalse võimenduse faas ja platoofaas.Taustsignaali faasi ajal varjatakse võimendatud fluorestsentssignaali fluorestsentsi taustsignaal ja toote koguse muutusi ei saa kindlaks teha.Platoofaasis ei suurene amplifikatsiooniprodukt enam eksponentsiaalselt, lõpp-produkti koguse ja algmatriitsi koguse vahel puudub lineaarne seos ning DNA algkoopiate arvu ei saa arvutada lõpliku PCR-produkti koguse põhjal.Ainult fluorestsentssignaali eksponentsiaalse võimenduse faasis on lineaarne seos PCR produkti koguse logaritmi ja algmatriitsi koguse vahel ning me saame selles etapis valida selle kvantifitseerimise.Kvantifitseerimise ja võrdlemise mugavuse huvides on reaalajas fluorestsents-kvantitatiivses PCR tehnikas kasutusele võetud kaks väga olulist kontseptsiooni: fluorestsentsi lävi ja CT väärtus.

Lävi on fluorestsentsi võimenduskõvera kunstlikult seatud väärtus.PCR amplifikatsiooni eksponentsiaalne faas.

Ct väärtus: on tsüklite arv, mille iga reaktsioonitoru fluorestsentssignaal on määratud domeeni väärtuse saavutamiseks läbinud.

Seos Ct väärtuse ja algmalli vahel: uuringud on näidanud, et iga malli Ct väärtusel on lineaarne seos selle malli algkoopia numbri logaritmiga, mida rohkem koopiaid on algkoopia numbrist, seda väiksem on Ct. väärtus.Ct väärtused on suhteliselt stabiilsed.Standardkõvera saab koostada, kasutades teadaoleva algkoopia numbriga standardit, kus horisontaalne koordinaat tähistab algkoopia numbri logaritmi ja vertikaalne koordinaat Ct väärtust, nagu on näidatud alloleval joonisel.

Seetõttu saab tundmatu proovi Ct väärtuse saamisel standardkõveralt arvutada selle proovi algkoopia numbri.

Ct väärtus ei ole konstantne ja seda võivad mõjutada erinevad näidised ja erinevad instrumendid, isegi kui sama näidist korratakse samal instrumendil 2 korda, võib Ct väärtus varieeruda.

Kvantitatiivsed fluorestsentsanalüüsid: Kvantitatiivsed fluorestsentsanalüüsid võib sõltuvalt kasutatud markeritest jagada fluorestseeruvateks sondideks ja fluorestsentsvärvideks.Fluorestseeruvad sondid hõlmavad Beacon-tehnoloogiat (molekulaarse majaka tehnoloogia, mida esindab American Tagyi), TaqMani sondid (esindaja ABI) ja FRET-tehnoloogiat (esindaja Roche);fluorestseeruvad värvid hõlmavad küllastunud fluorestseeruvaid värve ja küllastumata fluorestseeruvaid värvaineid, küllastumata fluorestseeruvate värvide tüüpiline esindaja on SYBRGreen I, mida praegu kasutatakse tavaliselt;küllastunud Tüüpiline küllastumata fluorestsentsvärvide esindaja on SYBRGreenⅠ;küllastunud fluorestseeruvad värvained on EvaGreen, LCGreen jne.

SYBRGreenI on fluorestsents-PCR jaoks tavaliselt kasutatav DNA-d siduv värv, mis seondub mittespetsiifiliselt kaheahelalise DNA-ga.Vabas olekus kiirgab SYBRGreenI nõrka fluorestsentsi, kuid pärast kaheahelalise DNA-ga seondumist suureneb selle fluorestsents 1000 korda.Seetõttu on reaktsioonist väljastatav kogu fluorestsentssignaal võrdeline olemasoleva kaheahelalise DNA kogusega ja suureneb amplifikatsiooniprodukti suurenedes.

Kaheahelaliste DNA sidumisvärvide eelised: lihtne eksperimentaalne ülesehitus, vaja on ainult 2 praimerit, pole vaja projekteerida sonde, pole vaja projekteerida mitut sondi mitme geeni kiireks testimiseks, võime teostada sulamistemperatuuri kõvera analüüsi, testida geenide spetsiifilisust. võimendusreaktsioon, madal algkulu, hea üldistus ja seetõttu sagedamini kasutatav uurimistöös nii kodu- kui välismaal.

Fluorestsentssondi meetod (Taqmani tehnika): PCR amplifikatsiooni läbiviimisel lisatakse praimerite paar koos spetsiifilise fluorestsentssondiga.Kui sond on terve, neeldub kustutatud rühm reporterrühma emiteeritud fluorestsentssignaali ja PCR-seade seda ei tuvasta;PCR amplifikatsiooni ajal (pikendusfaasis) lagundab Taq ensüümi 5'-3' lõhustamisaktiivsus sondi ensümaatiliselt, muutes reporterfluorestsentsrühmaks ja kustutatud fluorestsentsrühmaks.

Fluorestseeruva kvantitatiivse PCR rakendused.

Molekulaarbioloogia uuringud:

1. Kvantitatiivne nukleiinhapete analüüs.Nakkushaiguste kvantitatiivne ja kvalitatiivne analüüs, patogeensete mikroorganismide või viiruste tuvastamine, nagu hiljutine gripi A (H1N1) epideemia, transgeensete taimede ja loomade geenikoopiate arvu tuvastamine, RNAi geenide inaktivatsiooni määrade tuvastamine jne.

2. Diferentsiaalne geeniekspressiooni analüüs.Geeniekspressiooni erinevuste võrdlus töödeldud proovide vahel (nt medikamentoosne töötlemine, füüsikaline töötlemine, keemiline töötlemine jne), spetsiifiliste geenide ekspressioonierinevused erinevates faasides ja cDNA mikrokiibi või diferentsiaalse ekspressiooni tulemuste kinnitamine

3. SNP tuvastamine.Ühe nukleotiidi polümorfismide tuvastamine on oluline, et uurida individuaalset vastuvõtlikkust erinevatele haigustele või individuaalset reaktsiooni spetsiifilistele ravimitele ning molekulaarsete majakate geniaalse struktuuri tõttu on SNP järjestusteave teadaolevalt lihtne ja täpne. kasutage seda tehnikat suure läbilaskevõimega SNP tuvastamiseks.

4. Metüleerimise tuvastamine.Metüleerimist seostatakse paljude inimeste haigustega, eriti vähiga, ning Laird teatas tehnikast nimega Methylight, mis töötleb DNA-d enne amplifikatsiooni nii, et metüleerimata tsütosiinist saab uratsiil ja metüleeritud tsütosiin ei muutu, kasutades spetsiifilisi praimereid ja Taqmani sonde, et eristada metüleeritud ja metüleerimata DNA-d. .tundlikum.

Meditsiinilised uuringud:

1. Sünnieelne diagnoos: inimesed ei saa ravida muutunud geneetilisest materjalist põhjustatud pärilikke haigusi ning seni on võimalik vaid sünnieelse jälgimise teel vähendada sündivate haigete beebide arvu, et vältida erinevate pärilike haiguste esinemist.See on mitteinvasiivne meetod, mida rasedad naised kergesti aktsepteerivad.

2. Patogeeni tuvastamine: fluorestsents-kvantitatiivne PCR-analüüs võimaldab kvantitatiivselt määrata selliseid patogeene nagu gonokokk, Chlamydia trachomatis, Mycoplasma solium, inimese papilloomiviirus, herpes simplex viirus, inimese immuunpuudulikkuse viirus, hepatiidi viirus, gripiviirus, Mycobacterium EB tuberculosis, Mycobacterium EB tuberculosis.Selle eelisteks on kõrge tundlikkus, väike valimi suurus, kiirus ja lihtsus võrreldes traditsiooniliste testimismeetoditega.

3. Ravimi efektiivsuse hindamine: B-hepatiidi viiruse (HBV) ja C-hepatiidi viiruse (HCV) kvantitatiivne analüüs näitab seost viiruskoormuse ja teatud ravimite efektiivsuse vahel.Kui seerumi HBV-DNA tase lamivudiinravi ajal väheneb ja seejärel uuesti tõuseb või ületab eelmise taseme, viitab see viiruse mutatsioonile.

4. Onkogeneetiline testimine. Kuigi kasvaja arengu mehhanism ei ole veel selge, on laialdaselt aktsepteeritud, et onkogeense transformatsiooni aluseks on mutatsioonid asjakohastes geenides.Onkogeenide suurenenud ekspressiooni ja mutatsiooni võib täheldada paljude kasvajate varases staadiumis.Reaalajas fluorestsents-kvantitatiivne PCR ei ole mitte ainult efektiivne geenide mutatsioonide tuvastamisel, vaid suudab ka täpselt tuvastada onkogeenide ekspressiooni.Seda meetodit on kasutatud mitmesuguste geenide, sealhulgas telomeraasi hTERT geeni, kroonilise granulotsüütilise leukeemia WT1 geeni, onkogeense ER geeni, eesnäärmevähi PSM geeni ja kasvajaga seotud viirusgeenide ekspressiooni tuvastamiseks.

Tõlgitud saidiga www.DeepL.com/Translator (tasuta versioon)


Postitusaeg: 21. juuni 2022